万彩彩票在藥材凍干機制備蚯蚓纖溶酶凍干粉的方法ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ！真空冷凍干燥技術簡稱凍干技術♀☿☼☀☁☂☄，是一項對食品護色❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰、保鮮⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ、保質的高新加工技術❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰。目前廣泛用于果蔬⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺、肉禽⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾、水產ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ、調味品☈⊙☉℃℉❅、方便食品及名優特產等干燥ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，可達到保持食品原有的色☾☽❄☃、香✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅、味ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ、形ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ、新鮮度不變的目的☾☽❄☃，且復水性特好ⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，成品便于貯存和運輸①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，費用降低☾☽❄☃，保存期延長ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ。在干燥蜂皇漿㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦、人參ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ、龜✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅、鱉㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦、蚯蚓等營養保健品㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，采用真空冷凍干燥工藝☈⊙☉℃℉❅，更使人們相信該營養品純真自然☾☽❄☃。
真空凍干機制備蚯蚓纖溶酶凍干粉的方法ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，其特征在于㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，包括如下步驟：
步驟一㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉、蚯蚓粗粉的制備：將活蚯蚓⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，饑餓一天웃유ღ♋♂，自然吐凈泥沙ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，洗滌⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，而后在溫度介于2035℃的通風條件干燥并制成粉碎❣❦❧♡۵，通過100200目篩制成蚯蚓粗粉☈⊙☉℃℉❅；
步驟二⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾、粗酶溶液的制備：取蚯蚓粗粉用2倍體積的0.1mol/L①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，pH為7.8的磷酸緩沖液PBS勻漿ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，加0.1mol/LNaCl溶液ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，置于4℃冰箱內過夜⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，然后以10000r/min⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，4℃離心15minⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，棄沉淀☾☽❄☃，取上清⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺；上清液于50℃水浴保溫40min⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，流水冷卻⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，再8000r/min⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，4℃離心10minⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，取上清⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，在上清液中加硫酸銨達30%飽和度⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，靜置3小時㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，再8000r/min☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，4℃離心10min♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃；收集上清液再加硫酸銨達70%飽和度ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，靜置3小時ⓚⓛⓜⓝⓞⓟⓠⓡⓢ，再8000r/min☾☽❄☃，4℃離心10min✺ϟ☇♤♧♡♢♠♣♥，收集沉淀㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦；將沉淀溶于上述緩沖液中❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，對上述緩沖液以載留5KD分子量的透析袋透析過夜去鹽ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，再將透析液8000r/min❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，4℃離心10min⓱⓲⓳⓴⓵⓶⓷⓸⓹⓺⓻⓼⓽⓾，取上清液即為蚯蚓纖溶酶粗酶溶液⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯；
步驟三웃유ღ♋♂、粗酶的純化：將蚯蚓纖溶酶粗酶溶液過Sephadex G75凝膠層析ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，上柱前預先用0.02mol/L⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，pH為7.8的磷酸緩沖液平衡⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，上柱后用上述緩沖液洗脫至在280nm波長無光吸收ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，洗脫液出現2個蛋白峰❻❼❽❾❿⓫⓬⓭⓮⓯⓰，其中酶活性峰與第1個蛋白峰重疊ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，收集重疊部分的酶液ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，過DEAECellulose A52離子交換柱✤✥❋✦✧✩✰✪✫✬✭✮✯❂✡★✱✲✳✴，過柱前先用0.05mol/Lⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，pH為7.8的PBS平衡㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦；然后用含00.5mol/L NaCl的PBS離子強度線性梯度洗脫①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，洗脫液出現3個蛋白峰⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，酶活性峰與蛋白峰第3峰重疊⑰⑱⑲⑳⓪⓿❶❷❸❹❺，其余2個蛋白峰基本無酶活性웃유ღ♋♂，收集活性部分即為蚯蚓纖溶酶純酶㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦；
步驟四☾☽❄☃、蚯蚓纖溶酶的修飾：加入蚯蚓纖溶酶純酶和活化的PEG到15mL✵✶✷✸✹✺✻✼❄❅，pH9.2①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯，0.1mol/L的硼酸緩沖液中☧☬☸✡♁✙♆。，、＇：∶；，純酶與PEG的重量比是1:50❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，在30℃下㊀㊁㊂㊃㊄㊅㊆㊇㊈㊉，保溫反應1小時ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，反應物對0.1mol/LⓊⓋⓌⓍⓎⓏⓐⓑⓒⓓⓔⓕⓖⓗⓘⓙ，pH7.3的磷酸緩沖液透析過夜⒃⒄⒅⒆⒇⒈⒉⒊⒋⒌⒍⒎⒏⒐⒑⒒⒓，透析液再以10000r/min☾☽❄☃，4℃離心l0minⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ， 取上清液過柱Sephadex G75⒔⒕⒖⒗⒘⒙⒚⒛ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨⅩⅪⅫⅰⅱ，收集活性成分ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，即為蚯蚓纖溶酶修飾酶①②③④⑤⑥⑦⑧⑨⑩⑪⑫⑬⑭⑮⑯；
步驟五㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦、蚯蚓纖溶酶凍干粉的制備：將蚯蚓纖溶酶修飾酶裝在樣品盤里ⒺⒻⒼⒽⒾⒿⓀⓁⓂⓃⓄⓅⓆⓇⓈⓉ，料厚不超過8mm❋❀⚘☑✓✔√☐☒✗✘ㄨ✕✖✖⋆✢✣，放進真空冷凍干燥機設備干燥室內進行凍干웃유ღ♋♂，于-35℃冷凍12小時♦☜☞☝✍☚☛☟✌✽✾✿❁❃，然后在5pa的真空度下ⓣⓤⓥⓦⓧⓨⓩ，升溫至30℃㈠㈡㈢㈣㈤㈥㈦，干燥12小時♀☿☼☀☁☂☄；繼續升溫至40℃⒥⒦⒧⒨⒩⒪⒫⒬⒭⒮⒯⒰⒱⒲⒳⒴⒵❆❇❈❉❊†☨✞✝☥☦☓☩☯，真空干燥14小時ⅲⅳⅴⅵⅶⅷⅸⅹⒶⒷⒸⒹ，得到蚯蚓纖溶酶修飾酶的凍干粉♀☿☼☀☁☂☄，其含水量為7.0%㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，蛋白含量為68%㈧㈨㈩⑴⑵⑶⑷⑸⑹⑺⑻⑼⑽⑾⑿⒀⒁⒂，酶活力為1700U/mg♀☿☼☀☁☂☄。
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